Fundada con el nombre de Antioquia el 4 de diciembre de 1541 por el mariscal Jorge Robledo en el valle de Ebéjico, situado al sur de la población de Peque. La actual Santa Fe de Antioquia está ubicada en la subregión Occidente del departamento y se encontraba a una distancia de 79 km de Medellín (antes de la apertura en el 2006 del actual túnel de Occidente Fernando Gómez Martínez, por lo cual esta distancia se redujo a tan solo 55 km, disminuyendo el tiempo de viaje en más de una hora).
Una vez erigida la villa, el mariscal viajó a España en 1542 y debido a las hostilidades de los indígenas, fue trasladada —cerca de Frontino— por orden del capitán Juan Cabrera, el jueves 7 de septiembre del citado año. Antioquia recibió el título de ciudad en 1544 y se le otorgó escudo de armas en 1545.
A su regreso de la península en 1546, el mariscal Robledo fundó en el sitio donde hoy se encuentra, un pueblo minero que llamó Santa Fe, en honor a la mártir francesa Fe, muy popular en España. Robledo siguió al sur para encontrarse con Sebastián de Belalcázar, quien lo mata de garrote en la loma del pozo, cerca de Pácora, por orden del mismo Belalcázar.
Como Santa Fe comenzó a decaer, Belalcázar envió a Gaspar de Rodas, quien la repobló y le dio la categoría de villa en 1547. En ese mismo año, inició su vida parroquial. La gobernación de Antioquia fue erigida en 1569 y su primer gobernador fue Andrés de Valdivia.
Más adelante, los vecinos de la ciudad de Antioquia, debido a las repetidas incursiones de los aborígenes, se trasladaron a la villa de Santa Fe. De esta manera, la villa de Santa Fe y la ciudad de Antioquia se fusionaron, por lo que desde 1584, comenzó a llamarse Santa Fe de Antioquia.
El 30 de octubre del mismo año, el rey Felipe II de España, por real cédula dada en el palacio de El Pardo, instituyó la villa de Santa Fe de Antioquia en la capital de la provincia del mismo nombre, título que conservó hasta 1826.
